Retrograde protein trafficking of Emp47p in the early secretory pathway of S. cerevisiae

A novel mutant-screen uncovers the influence of oxidative stress on protein trafficking

Matiach, Aleksei

kassel university press, ISBN: 978-3-933146-69-4, 2001

URN: urn:nbn:de:0002-698

Zugl.: Kassel, Univ., Diss. 2001

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Inhalt: Der retrograde membranvermittelte Transport vom Golgi-Komplex zurück zum Endoplasmatischen Reticulum (ER) wird durch COP I Transportvesikel bewirkt. Mutationen in der COP I Maschinerie führen zu einer Fehllokalisierung von Emp47p zur Vakuole, wo das protein rasch durch vakuoläre Proteasen abgebaut wird. In meiner Arbeit benutzte ich chemische Mutagenese, um Zufallsmutanten zu erzeugen, unter denen ich nach solchen suchte, die auf Temperatur-sensitive Weise eine verminderte Menge von Emp47p aufwiesen. Eine Mutante, die Emp47p zur Vakuole fehlleitete wies einen Defekt in CYS3 auf. Diese Gen kodiert für Cystathionine-g-Lyase (Cys3p). Ich fand Hinweise für den Schluss, dass die Störung der Lokalisation von Emp47p tatsächlich auf der Unfähigkeit der Mutante beruht, Cystein zu produzieren, das als Bestandteil des Tripeptids Glutathion (GSH) und der aktiven Zentren von Mono- und Dithiolproteinen entscheidend für die Reduktionskraft des Zytosols verantwortlich ist. Ich fand zudem Hinweise, die die allgemeine Wichtigkeit von Glutathion beim Schutz vor Hitze und oxidativem Stress weiter stützen. Insbesondere identifizierte ich ein Phospholipid, CDP-Diacylglcerol, als ein GSH-abhängiges Substrat im Adaptationsprozess bei Hitze-Stress, der in cys3-2 –Zellen defekt ist.

In der vorliegenden Arbeit wurde auch die intrazelluläre Lokalisation und das Recycling-Verhalten des bislang nicht charakterisierten Produktes des Leserahmens YLR080W untersucht, eines nicht essentiellen TypI-Transmembranproteins, das 45% Identität mit der Primärsequenz von Emp47 aufweist. Es konnte von mir gezeigt werden, dass der ein Di-Lysin-Motiv enthaltende C-Terminus des Ylr080w-Protein dessen Lokalisation auf den Bereich ER/Golgi begrenzt. In Zellen aus der frühen logarithmischen Wachstumsphase ist die Lokalisation von Ylr80wp nicht von der von Emp47p zu unterscheiden. Zur stationären Phase hin jedoch wird – völlig im Unterschied zu Emp47p – die Produktion von Ylr080wp um einen Faktor von mindestens 50 erhöht. Gleichzeitig wird das Protein vom Golgi zum ER umverteilt. Ähnlich wie bei Emp47p ist die Lokalisation von Ylr080wp abhängig vom di-Lysin-Signal und „Coatomer“. Mutationen im di-Lysin-Motiv und in Genen, die für „Coatomer“-Untereinheiten kodieren, führen beide zur Fehllokalisation von Ylr080wp zur Vakuole. Die Blockierung des Proteinstransports aus dem ER heraus mit Hilfe von konditionalen COP II-Mutanten wie zum Beispiel sec23-1 und gleichzeitiger Hemmung der Proteinbiosynthese führte zu einer Umverteilung von Ylr080wp zum ER. Dies gilt als Beweis dafür, dass ein Protein zwischen Golgi und ER zirkuliert.

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